BnMPK3

۵′-ATGAACAACGCCGGCGGCCA-3′

۵′-CTAAGCATATGTTGGATTGAGTGC-3′

BnMPK4

۵′-TTGTATCAGTTGTTGCGTGGG-3′

۵′-TGAAGTCAGTCTCGGATTTGGTC-3′

Actin2

۵′- GTGTTGTTGGTAGGCCAAGACATCA-3′

۵′ -CTTGATGTCTCTTACAATTTCCCGC-3′

۲-۳ روش­های بکار گرفته شده در آزمایشات فیزیولوژیکی
۲-۳-۱ طرز تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیم­ های آسکوربات و گایاکول پراکسیداز
برای تهیه عصاره گیاهی از روش (Kang and Saltiveit, 2002) با اندکی تغییرات استفاده شد. g5/0 وزن تر بافت از هر دو اندام ریشه و اندام هوایی بطور جداگانه از کلیه تیمارها توزین گردید و سپس به داخل هاون سرد منتقل شد و توسط ml 3 بافر شامل ( بافر تریس- HCl 05/0 مولار با PH 5/7 ، MgCl₂ ۳ میلی مولار ، EDTA 1 میلی مولار) با دسته هاون خوب له شد. بافر استخراجی جهت اندازه ­گیری فعـــالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) شامل۲ میلی مولار آسکوربات نیز بود. هموژنات سپس به مدت ۲۰ دقیقه با نیروی g5000 سانتریفوژ شد. محلول رویی (Supernatant)

حاصله به عنوان عصاره خام برای اندازه ­گیری فعالیت آنزیم­ های آنتی­اکسیدان استفاده گردید.
۲-۳-۱-۱ اندازه ­گیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز(APX)
فعالیت آنزیم APX در تمام تیمارها و تکرارها با بهره گرفتن از روش and Azada, 1981) (Nakano، با اندکی تغییرات اندازه ­گیری شد. ml3 بافر فسفات ۵۰ میلی مولار با PH 7 شـامل (EDTA 1/0میلی مولار، آسکوربات سدیم ۵/۰ میلی مولار، ml 2/0 ‌H₂O₂ %۱ (w/v)) برداشته و روی آن ml 1/0 آنزیم استخراجی اضافه نموده سپس فعالیت آنزیم ازطریق اکسید شدن آسکوربات توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm 290 اندازه ­گیری شد که همراه با کاهش جذب در طی یک دقیقه فعالیت آنزیم بود. برای سنجش میزان فعالیت از ضریب خاموشی (m M^-1 cm^-18/2) و فرمول زیر استفاده شد.
Units (mM/min) =
۲-۳-۱-۲ اندازه ­گیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز(GPX)
فعالیت (GPX) در کلیه تیمارها و تکرارها با استفــاده از روش et al., ۱۹۸۵) (Upadhyayaانجام گرفت. مخلوط واکنش شامل ۵/۲ میلی لیتر بافر فسفات ۵۰ میلی مولار (۷pH=)، ۱ میلی لیتر گایاکول ۱درصد، ۳/۰ میلی لیتر عصاره­ی آنزیمی بود. بعد از رسیدن به تعادل به مدت ۱ دقیقه در cº۳۰ ، واکنش با افزودن ۱میلی لیتر H₂O₂یک درصد شروع شد. فعالیت GPXبه صورت افزایش در جذب طی ۱ دقیقه در طول موج ۴۲۰ نانومتر محاسبه شد.برای سنجش میزان فعالیت آنزیم از ضریب خاموشی ( m M^-1 cm^-16/26) و فرمول زیر استفاده شد.
Units (mM/min) =
۲-۳-۲ سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز
سنجش فعالیت آنزیم CAT با بهره گرفتن از روش (۱۹۸۴ Aebi,) انجام شد. مخلوط واکنش شامل ۳ میلی لیتر بافر فسفات ۵۰ میلی مولار (۷pH=) محتوی ۲/۰ میلی لیتر H₂O₂1درصد و lµ۵۰ عصاره­ی استخراجی بود. فعالیت آنزیم CAT به صورت کاهش در جذب H₂O₂ طی ۱ دقیقه در طول موج ۲۴۰ نانومتر محاسبه شد. یک واحد آنزیمی برای فعالیت کاتالاز به صورت مقدار آنزیم مورد نیاز برای اکسیده کردن Mµ ۱ H₂O₂در هر دقیقه تعریف می­ شود. برای سنجش میزان فعالیت از ضریب خاموشی ( mM^-1 cm^-10436/0) و فرمول زیر استفاده شد.
Units (mM/min) =
۲-۳-۳ اندازه ­گیری میزان پراکسیداسیون چربی­ها (MDA)
برای اندازه ­گیری میزان پراکسیداسیون چربی­ها از روش (Heath and Packer, 1986)، استفاده گردید. ۱ گرم بافت تر توزین و توسط ml 5 محلول تری­کلرواستیک­اسید %۵ خوب له شده سپس محلول حاصله به مدت ۱۵ دقیقه با نیروی g 15000 سانتریفوژ شد. بعد از عمل سانتریفوژ، حجم مساوی از عصاره و تیوباربیوتیک اسید (%۵/۰در تری­کلرو استیک­اسید %۲۰) به داخل لوله آزمایش منتقل شده و به مدت ۲۵ دقیقه در بن­ماری cº۹۵ جوشانده شد. نهایتا لوله­ها را به مدت ۵ دقیقه وارد آب یخ نموده و بعد به مدت ۵ دقیقه در داخل سانتریفوژ با نیروی g 10000 گذاشته شد. میزان جذب محلول رویی توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm 532 سنجش شد و میزان جذب در nm 600 از آن کم شد. میزان MDA از ضریب خاموشی ( mM^-1cm^-1155 (و با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد.
MDA (µmol/g FW)= [A532-A600/155] × ۱۰۰۰
۲-۳-۴ اندازه ­گیری پروتئین کل
برای تعیین پروتئین کل از روش فولن لوری۱۹۵۱) (Lowry et al., استفاده شد. برای تعیین پروتئین کل ۰۵/۰ گرم ماده خشک از ریشه و اندام هوایی نمونه­های گیاهی توزین شد و بر روی آنها ml 5 بافر تریس اسید کلریدریک (pH= 8) ml) 50 تریس ۲/۰ نرمال، ۲/۱۷ گرم ساکارز و ۱/۰ گرم اسید آسکوربیک در آب حل شده و در نهایت حجم محلول با آب مقطر به ml 100رسانده شد) اضافه کرده و خوب بهم زده و به مدت ۳۰ دقیقه بر روی شیکر گذاشته شد و سپس به مدت ۳۰ دقیقه با نیروی g 5000 سانتریفوژ گردید. فاز رویی حاوی پروتئین محلول است. بر روی عصاره­ی پروتئینی محلولهای A، B و C اضافه می­ شود:
معرف­های A ، B ، C را طبق فرمول زیر و به ترتیب زیر به عصاره­ی پروتئین اضافه گردید.
محلول A : ۲ گرم کربنات سدیم (Na₂Co₃)، ۴/۰ گرم NaOH ، ۰۲_‌/۰ گرم نمک راشل (تارتارات سدیم، پتاسیم، H₂O₄، C₄H₄KNaO₆) در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد.
محلولB : ۵/۰ گرم سولفات مس متبلور (۵H₂O ،CuSO₄) در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد.
محلول C : ۵۰ میلی لیتر محلول A با یک میلی لیتر محلول B بلا­فاصله قبل از مصرف با هم مخلوط شدند.
یک میلی لیتر از نمونه (فاز رویی) را با ۴ میلی لیتر از محلول C به خوبی مخلوط نموده و ۱۰ دقیقه به حال خود گذاشته تا کاملا حل گردد. بعدا ۵/۱ میلی لیتر از محلول رقیق شده فولین سیوکالتئو که قبلا به نسبت ۹:۱ با آب مقطر رقیق شده بود به آن افزوده و ۳۰ دقیقه در تاریکی قرار داده شدند. کمپلکس آبی رنگی ایجاد گردید. در نهایت جذب آن در طول موج nm660 به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین و با بهره گرفتن از منحنی استاندارد پروتئین ، میزان پروتئین برحسب (mg g^-1 DW) محاسبه گردید. برای شاهد بجای نمونه از آب مقطر استفاده شده و مراحل فوق در مورد آن اعمال گردید. به دلیل بالا بودن شدت رنگ همه نمونه­ها به نسبت ۱:۱ با آب مقطر رقیق شدند.
۲-۳-۵ اندازه ­گیری قندهای محلول
میزان قندهای محلول به روش فنل سولفوریک ( حدادچی، ۱۳۶۵) و براساس هیدرولیز اسیدی قند­های محلول و ایجاد ترکیب فورفورال که با فنل یک کمپلکس رنگی تولید کرده، اندازه ­گیری شد. ۵/۰ گرم وزن تر گیاه از هر تیمار توزین شد و در داخل ml 5 آب مقطر به وسیله هاون خوب له گردید سپس با تنظیف صاف شده و از عصـــاره­ی گیاهی حاصله ml2 برداشته و به داخل یک لوله آزمــایش منتقل گردید، روی آن ml 1 فنل %۵ (w/v) ریخته و در نهایت روی هر کدام از لوله­ها ml 3 اسید سولفوریک %۹۸ اضافه گردید، لوله­ها به مدت ۱ ساعت به حال خود رهــا شدند تا رنگ ظاهر و تثبیت شود. برای شاهد بجای عصاره گیاهی از ml 2 آب مقطر استفاده گردیده و مراحل فوق در مورد آن نیز اجرا شد. بعد از ظهور رنگ میزان جذب در nm 485 توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه ­گیری و با بهره گرفتن از منحنی استاندارد قند­های محلول، میزان قند در ریشه و اندام هوایی گیاهان شاهد و تحت تیمار تعیین گردیده و در نهایت میزان قندهای محلول بر حسب (mg g^-1 DW) محاسبه گردید.
۲-۴ آنالیزهای آماری
مقادیر میانگین در ۳ تکرار بدست آمد و انحراف معیار میانگین­ها محاسبه گردید. اختلاف میانگین­ها با بهره گرفتن از آنالیز واریانس یک­طرفه (ONE WAY ANOVA) محاسبه شد. گروه­بندی تیمارها در سطح احتمال %۵ (P˂۰.۰۵) با آزمون چند دامنه­ای Tukey انجام شد. آنالیز آماری داده ­ها با بهره گرفتن از نرم افزار spss نسخه ۱۸ انجام شد و نمودار­ها نیز با بهره گرفتن از نرم افزار Excel سری ۲۰۱۰ رسم شدند.
فصل سوم:
نتایج
۳-۱ نتایج حاصل از بررسی­های انجام یافته در سطح مولکولی
۳-۱-۱ بررسی بیان ژن Protein Kinase تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)
در این مطالعه، در گیاهچه­های (Seedlings) کلزا رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژن پروتئین­کیناز(PK) نسبت به کنترل (زمان صفر) به­ طور معنی­داری افزایش یافت. به­ طوری­که بیان آن بعد از ۳ ساعت تغییر قابل توجهی نداشته، اما به­تدریج افزایش یافته و بیشترین میزان بیان را در ۱۲ ساعت نشان داد. با این حال در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژن PK نسبت به زمان کنترل کاهش معنی­داری داشته و در ۱۲ ساعت کمترین بیان را نشان داد.
Control