سلولهای سوسپانت

هر ۲-۳ روز یک بار انجام گردید، ابتدا سلولهای سوسپانت را درون فالکون ۱۴ سی سی می ریزیم، سپس در سانتریقیوژ در دور ۱۴۰۰ به مدت ۷ دقیقه قرار داده شد و بعد از آن محیط رویی را دور ریخته و رسوب انتهایی را به ۲ قسمت تقسیم کرده و در دو فلاسک ریخته و بعد به میزان ۷ سی سی محیط کشت RPMI 1640 +20% FBS ریخته شد و در انکوباتور ۳۷ درجه و CO2 ۵% قرار داده می شود.

فریز کردن

ابتدا سلو لها را از انکو باتور خارج شد و بعد از ترپسینه کردن برای سلولهای چسبنده سلولها را در فالکون ۵۰ سی سی قرار داده شد و با دور ۱۴۰۰ به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ شد و بعد از آن محیط رویی دور ریخته شد و سلولها را در محلول حاوی ۹۵% FBS و ۵ % DMSO را مخلوط کرده و بعد به مدت ۲۴ ساعت در ۲۰- درجه سانتی گراد و بعد از آن در ۷۰- قرار داده شد .

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت tinoz.ir مراجعه کنید.

طرز تهیه FBS دکمپلمان برای استفاده در کشت سلولی

FBS فریز شده را به مدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور قرار داده شد تا ذوب شود و بعد از آن به مدت ۲۰ دقیقه در بن ماری ۵۶ درجه قرار داده شد و بعد از آن به مدت ۷ دقیقه در دور ۱۴۰۰ قرار داده شد و بعد از آن در داخل یخچال ۴ درجه قرارداده شد.

ذوب کردن

ابتدا طبق پروتکل ذکر شده دفریزینگ برای هر کدام از سلولها صورت گرفت به این صورت که ابتدا به ان ۲ سی سی محیط کشت RPMI1640 بدون FBS اضافه گردید مخلوط گردیده و سپس در یک فالکون ۱۵ قرار داده شد و بعد از ۷ سی سی دوباره محیط کشت بدون FBS اضافه می کنیم و در دور ۱۴۰۰ به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ شد و سپس محیط رویی را دور ریخته و رسوب فالکون را به میزان ۵ سی سی از محیط کشت RPMI 1640 +FBS 20% اضافه می کنیم و بعد از چند بار مخلوط کردن آن را داخل یک فلاسک ۵۰ سی سی قرار داده شد و در انکوباتور ۳۷ درجه و دی اکسید کربن ۵% قرار داده شد.

شمارش سلولی

برای شمارش سلولها ، ابتدا سلولها داخل فالکون ۱۴ ریخته شدو در دور ۱۴۰۰ به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ شد و بعد از آن محتوای رویی را دور ریخته و محتوای انتهای فالکون ۱ سی سی به ان محیط کشت اضافه شدو در سلولهای چسبنده و همچنین سلولهای سوسپانت به میزان ۱۰۰ ماکرولیتر از آن با همان میزان۱۰۰ ماکرولیتر از تریپان بلو مخلوط شده و در زیرلام نئوبار توسط میکروسکوپ معکوس شمارش که سلو لهای دبری رنگ آبی تریپان بلو را جذب می کنند و به رنگ آبی در می آیند وسلو لهای زنده به رنگ شفاف هستند و در نهایت تعداد سلو لها ازطریق فرمول “تعداد سلولهای زنده× ۱۰۴× ۲ ” محاسبه شدند.
و همچنین از طریق فرمول زیر مقادیرViability محاسبه شد:
تعداد سلو لهای زنده × ۱۰۰
تعداد سلولهای مرده

MTT Assay

MTT یک روش حساس و کیفی و راحت برای ارزیابی پاسخ یک جمعیت سلولی به یک عامل خارجی است که توسط این روش میتوان افزایش یا کاهش جمعیت سلولی را مطالعه کرد. کاهش می تواند به علت ایجاد آپاپتوزیس یا نکروز باشد .در این روش ابتدا سلو لها رویت شد و هر ۳ روز محیط کشت سلو لها تعویض شد و بعد از ۲ هفته تعداد سلو لها به میزانی که برای MTT لازم بود رسید و در این تست ابتدا طبق پروتکلی که ذکر شد سلولها شمارش شدند و میزان آن ۷۷۸۰۰۰۰ شد و در Well 96 خانه ای در هر خانه به میزان ۴۰۰۰۰ سلول ریخته شد و به صورت Triplicate این تست در زمان های ۲۴ و ۴۸ و ۷۲ ساعت انجام گردید.۷۷۸۰۰۰۰ را در ۱۰۰۰ ماکرولیتر محیط کشت مخلوط کرده و سپس ۴۰۰۰۰ سلول را به خانه های ۹۶ اضافه میکنیم و بعد میزان هر Wellرا ۲۹۵ ماکرولیتر از محیط کشت با FBS به ۳۰۰ ماکرو لیتر رسانده شد و سلو لها به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه و CO2 ۵% قرار داده شد و سپس تیمار با پپتیدهای طراحی شده به مدت ۲۴،۴۸،۷۲ ساعت تیمار شدند.
پروتکل MTT به صورت خلاصه در زیر بیان شده است:
۱٫ ابتدا به میزان ۱۲۵ ماکرولیتر (RPMI 1640+10% FBS) به همه سلولاها اضافه می کنیم.
۲٫ به همه Well میزان ۵۰۰۰ سلول اضافه می کنیم.
۳٫ در انکوباتور ۳۷ درجه + ۵% CO2 به صورت overnight قرار داده شد.
۴٫ محیط کشت رویی برداشته می شود.
۵٫ غلظت های مختلف از پپتید ها با غلظت های متفاوت به well های مرتبط اضافه می شود.
۶٫ انکوبه در زمان های مورد نظر در MTT( به مدت ۲۴, ۴۸، ۷۲)
۷٫ محیط کشت رویی دور ریخته شد.
۸٫ در این مرحله به میزان ۳۰ ماکرولیتراز محلولMTT 2% و ۹۰ ماکرولیتر محیط کشت اضافه می کنیم.
۹٫به مدت ۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه انکوبه شد.
۱۰٫ محیط کشت رویی برداشته شد و به میزان ۱۰۰ ماکرولیتر DMSO اضافه میکنیم و به مدت ۱۰ دقیقه انکوبه می شود.
۱۱٫در طول موج ۵۹۵ نانومتر توسط دستگاه الیزا Reader خوانده شد .

غلظتهای استفاده شده برای پپتید

پپتید های طراحی شده به شرکت Tag copeghene در دانمارک سفارش داده شدند و وزن مولکولی پپتید ۱ با توالی TGLDSDGLYQN 1176.17 گرم در یک مول می باشد ، وزن مولکولی پپتید ۲ با توالی NTDLLNSNDNG 1322.36 می باشد و برای توالی سیکلوتراکسین TKCNPMGYTKE، به عنوان کنترل مٍثبت ۱۲۷۱٫۴۸ است. در این مطالعه برای اندازه گیری میزان پپتید ها از فرمول C1V1=C2V2 استفاده شد و از غلظتهای ۵۰ و ۲۰۰ و ۳۵۰ و ۵۰۰ نانومولار برای تیمار سلولی استفاده گردید.

فلو سایتو متری

ابتدا کیت فلوسایتومتری با کد ۶۴۰۹۰۶ از شرکت biolegendاز کشور آمریکا خریداری شد با بهره گرفتن از پروتکل زیر مراحل فلو سایتو متری انجام شد :
۱٫ ابتدا هزار سلول از هر رده سلولی در پلیت ۶ خانه ای به مدت ۱ روز انکوبه در دمای ۳۷ درجه و دی اکسید کربن ۵% کشت داده شده اند،سپس تیمار سلولی در غلظتهای مختلف ۵۰، ۲۰۰، ۳۵۰، ۵۰۰ نانو مولار به مدت ۲۴ و ۴۸ و ۷۲ ساعت اثرداده شد.
۲٫سپس محیط رویی آنها در یک ویال ۲سی سی ریخته شد و بعد از آن سلولهای چسبنده تریپسینه شده اند ، بعد در این مرحله ۲ بار سلولها با میزان ۳ سی سی PBS شسته شدند به مدت ۷ دقیقه در دور ۱۴۰۰ سانتریفیوژ شده اند. (این عمل دو بار انجام گردید) .
۳٫محیط رویی را خارج کرده و به میزان ۵۰ ماکرولیتر Binding Bufferاضافه شد.
۴٫ به میزان ۲٫۵ ماکرولیتر از رنگ Annexin V اضافه گردیده شد.
۵٫ به میزان ۵ لاندا ( PI(5 mg.ml ساخته شده است به آن اضافه گردید وبعد نمونه را به آرامی تکان داده و سپس به مدت ۱۵ دقیقه در دمای محیط در اتاق تاریک قرار داده شد .
۶٫ در این مرحله نمونه ، آماده برای قرار دادن در دستگاه فلوسایتومتری می باشد و که نمونه را با باندینگ بافر به حجم ۱ سی سی رسانیده شد .
۷٫ در مرحله آخر نمونه ها در دستگاه فلوسایتومتری (BD company ) برای بررسی کردن میزان آپاپتوزیس و سلو لهای دبری و سلولهای زنده قرار داده شد.
استخراج پروتئین
برای استخراج پروتئین پروتکل زیر مورد استفاده قرار گرفته شد:
.۱ ابتدا ۱۰۶×۱ سلول کشت داده شد وسلو لهای چسبنده تریپسینه شد، سلولهای سوسپانت بدون تریپسینه کردن برای استخراج پروتئین مورد استفاده قرار داده شد.
۲٫ در این مرحله برای جمع آوری کردن سلو لها بدین ترتیب که نمونه داخل میکروتیوپ را با ۱ سی سی از washing buffer مخلوط کرده و به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۳۰۰۰۰ سانتریفیوژ شد (سه باراین کار انجام گردیده شد ).
مواد مورد استفاده برای جمع آوری کردن(Harvest) سلول :
Tris stock
Tris base 6.057 gr hn 1M
Ultra pure water 35 ml
Hcl adjust to PH 7
Double diluted water to 50 ml
Washing solution cell line:
Tris stock 0.3 mole From 1 molar
Sugar 25.62 gr 25 μl
With D.D.W Up to 30 cc
.۳ بعد از این که سلولها جمع آوریو شستشو داده شده اند ، دوباره در سانتریفیوژ در دور ۳۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه قرار داده شد و محیط رویی دور ریخته شد وبه رسوب میزان ۱۰۰ ماکرولیتر از لیز بافر و همچنین به میزان ۱۰ ماکرولیتر از محلول PMSF (برای جلوگیری از فعالیت Protease inhibitors ) اضافه شد .
۴٫ به آرامی ورتکس انجام گردید.
۵٫ به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق ۲۵ درجه قرار داده شد و هر ۱۵ دقیقه به آرامی ورتکس انجام گردید.
۶٫ در مرحله آخر بعد از ۱ ساعت در سانتریفیوژ در دور ۱۳۰۰۰ در دمای ۴ درجه به مدت ۱۰ دقیقه قرار داده شد .
۷٫ مایع سوپرناتانت که پروتئین می باشد جمع آوری شد و رسوب آن دور ریخته شد.
۸٫ سپس در دمای -۷۰ درجه نگهداری شد.
مواد مورد استفاده برای لیز بافر
Lysis buffer stock
Material Amount final concentration
Urea 4.2042gr 7 M
Thiourea 1.522 gr 2 M
CHAPS 0.4 gr 4%
Tris stock solution 0.4 ml 40 mM
۱۰۰x biolyte 3.10 0.1 ml 0.2 %
Ultra pure water up to 10 ml
Lysis buffer :
Dithithiritol (DTT) 77 mg 50 mM
Lysis buffer stock 1ml