هر یک از سویههای باکتریایی یک روز قبل از انجام آزمون میکروبی بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار ذکر شده، کشت سطحی داده شدند تا میکروارگانیسمها پس از یک شب انکوباسیون در هنگام تهیه سوسپانسیون میکروبی در فاز لگاریتمی قرار داشته باشند.
۲-۸ تهیه استاندارد نیم مکفارلند[۵۰]
۵/۰ میلیلیتر از کلرید باریم[۵۱] ۱۷۵/۱% با ۵/۹ میلیلیتر اسید سولفوریک ۱% را داخل لوله آزمایش استریل دربدار اضافه و توسط دستگاه ورتکس هم زده شد. تعداد تقریبی باکتری ها ۱۵۰۰ میلیون در میلیلیتر است. این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظروف درببسته می تواند مورد استفاده قرار گیرد اما با این اوصاف، اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود.
۲-۹ تهیه سوسپانسیون میکروبی
به وسیله لوپ از کلنی هرکدام از باکتری ها برداشته و در یک لوله آزمایش استریل حاوی ۹ میلیلیتر سرم فیزیولوژی استریل (یا محلول نمکی NaCl 8.5 g/ l) کاملا مخلوط کرده به طوری که سوسپانسیون کاملا یکنواختی از باکتری مورد آزمایش بهدست آید. سپس جذب نوری این سوسپانسیون در طول موج ۶۲۵ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر، در مقابل بلانک خوانده می شود تا کدورتی معادل استاندارد ۵/۰ مک فارلند ۱۰۸ ×۵/۱ داشته باشد.
۲-۱۰ آزمونهای میکروبی
۲-۱۰-۱ تست دیسک دیفیوژن
حساسیت میکروارگانیسمهای بیمارستانی به عصارهها با بهره گرفتن از روش نفوذ انتشاری[۵۲] بررسی گردید. جهت انجام این آزمایش، مقدار مشخصی از عصارههای خشک گیاهی در حلال DMSO استریل شده، حل و سپس غلظتهای ۱۰۰۰، ۷۵۰، ۵۰۰، ۲۵۰ و ۱۲۵ میلیگرم بر میلیلیتر تهیه شدند. در روش کیفی نفوذ انتشاری از روش بائر کربی[۵۳] استفاده شد [۸۱]. ۱۰۰ میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی روی سطح محیط کشت مولر هینتون آگار چکانده شد و با یک سوآپ کتان استریل روی محیط گسترش یافت. دیسکهای خام استریل به قطر ۶ میلیمتر توسط پنس استریل روی سطح محیط کشت در زیر دستگاه لامینارفلو به فاصله معین از یکدیگر و از لبه پلیت قرار داده شد و ۲۰ میکرولیتر از محلول عصارهها با غلظتهای مشخص روی دیسکها چکانده شد. در این آزمایش دیسک حاوی آنتیبیوتیکهای مورد مطالعه به عنوان شاهد مثبت و دیسکهای حاوی DMSO به عنوان شاهد منفی استفاده شد. پلیتها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شدند [۸۲]. از آن جایی که عصارهها دارای رنگ بودند، با توجه به انتشار رنگ در محیط توانستیم انتشار عصاره را نیز ردیابی کنیم. اندازه گیری قطر هاله عدم رشد زیر نظر کارشناس متخصص آزمایشگاه و در شرایط آسپتیک با بهره گرفتن از خطکش ثبت شد.
شکل ۲-۱: اندازه گیری قطر هاله عدم رشد با خطکش میلیمتری
برای حصول اطمینان، این آزمایش برای هر سویه باکتری سه بار تکرار گردید و میانگین قطر هاله عدم رشد به عنوان قطر نهایی ثبت شد. قطر هاله عدم رشد کمتر از ۷ به عنوان مقاوم، ۹-۷ نسبتا مقاوم، ۱۲-۱۰ نسبتا حسّاس و بیشتر از ۱۲ میلیمتر به عنوان حسّاس در نظر گرفته شد شکل (۲-۱) [۸۳].
۲-۱۰-۲ تست آنتیبیوگرام
به دلیل عدم وجود یک استاندارد خاص در مورد میزان استفاده از عصاره گیاهی از دیسکهای آنتیبیوتیکی به عنوان یک استاندارد و شاهد استفاده شد. جهت بررسی حساسیت سویهها به آنتیبیوتیکهای استاندارد مورد مطالعه، ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده را به روش سطحی روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده و سپس دیسکهای آنتیبیوتیک را در فاصلههای معین روی محیط قرار داده و پلیتها به مدت ۲۴ ساعت جهت بررسی هاله عدم رشد در شرایط میکروآئروفیلیک گرمخانهگذاری شدند [۸۷-۸۴]. با اندازه گیری قطر هاله عدم رشد به سادگی میتوان حساسیت باکتری ها نسبت به آنتیبیوتیک را تعیین نمود. تست آنتیبیوگرام با مقاوم[۵۴]، نیمهحساس[۵۵] و حساس[۵۶] گزارش می شود.
۲-۱۰-۳ تعیین حداقل غلظت بازدارندگی[۵۷]و حداقل غلظت کشندگی[۵۸]
جهت انجام آزمایشهای کمی برای حداقل غلظت بازدارندگی از رشد میکروارگانیسم [۸۸] و حداقل غلظت کشندگی میکروارگانیسم [۸۹] از روش رقت لولهای[۵۹] استفاده شد.
MIC: غلظتی از یک عصاره است که می تواند از رشد باکتری در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری کند.
MBC: کمترین غلظتی از عصاره که می تواند سبب نابودی بیشترین تعداد باکتری (۹/۹۹%) شود.
۲-۱۰-۳-۱ تعیین MIC عصاره
برای تعیین MIC با روش رقت لولهای از یک سری لولههای آزمایش ۱۰ تایی استفاده شد. ۷ لوله برای غلظتهای مختلف هر عصاره گیاهی و یک لوله به عنوان کنترل مثبت (حاوی سوسپانسیون میکروبی و DMSO فاقد عصاره)، یک لوله به عنوان کنترل مثبت مثبت (حاوی سوسپانسیون میکروبی فاقد عصاره) و یک لوله به عنوان کنترل منفی (دارای محیط کشت و عصاره بدون سوسپانسیون میکروبی) در نظر گرفته شد.
به هر کدام از لولهها cc1 محیط کشت مولر هینتون براث اضافه و به لوله اول cc1 عصاره استوک با غلظت ۱۰۰۰ میلیگرم بر میلیلیتر اضافه گردید. پس از مخلوط کردن، cc1 از لوله اول به لوله دوم و سپس cc1 از لوله دوم به لوله سوم، بههمین ترتیب تا لوله هشتم انجام شد و سرانجام cc1 از آن به بیرون ریخته شد. به تمامی لولهها ۵۰ میکرولیتر از هر سوسپانسیون میکروبی اضافه گردید [۹۰، ۹۱]. به این ترتیب غلظت عصاره در لولههای ۱ تا ۸: ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶۲/۱۵، ۸/۷ و ۹/۳ میلیگرم بر میلیلیتر بود. تمامی لولهها به مدّت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار گرفتند. پس از گذشت مدت زمان لازم پلیتها از گرمخانه خارج و جهت تعیین MIC مورد بررسی قرار میگیرند.
برای تعیین MIC عصارهها از محلول ۵ میلیگرم بر میلیلیتر نیتروبلو تترازولیوم کلراید، مقدار ۵۰ میکرولیتر در تمام لولههای آزمایش ریخته و مجددا به مدت ۳ ساعت در گرمخانه انکوبه میشوند. یک غلظت بالاتر از آخرین غلظتی که رنگ بنفش تترازولیوم را به خود گرفته، به عنوان MIC عصاره برای میکروب مورد نظر، در نظر گرفته می شود [۹۲].
۲-۱۰-۳-۲ تعیین MBC عصاره
به منظور تعیین MBC عصاره از هر کدام از لولههای آزمایش که رنگ بنفش نگرفتهاند ۵ میکرولیتر بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده می شود سپس پلیتها به مدت ۲۴ ساعت در گرمخانه ۳۷ درجه قرار داده میشوند. پس از گذشت زمان لازم پلیتها از گرمخانه خارج و نتایج آن بررسی می شود. غلظتی که در آن رشدی دیده نشود، به عنوان MBC عصاره برای میکروب مورد نظر گرفته می شود [۹۳].
۲-۱۱ بررسی خواص فیتوشیمیایی اولیه
برای انجام این آزمایشات غلظتهای ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶/۱۵ و ۸/۷ میلیگرم برمیلیلیتر از عصاره خشک گیاهان مورد مطالعه به منظور بررسی وجود آلکالوئید، تانن، ساپونین و آنتوسیانین به شرح ذیل به کار گرفته شد.
۲-۱۱-۱ آلکالوئید
۲۵۰ میلیلیتر از غلظتهای مختلف عصاره گیاهان تهیه و ۵ میلیلیتر اسید کلریدریک ۱% به آنها اضافه و به مدت ۵ دقیقه جوشانده و سپس حجم به میزان اولیه رسانده شد و محلول اسیدی حاصل با کاغذ صافی، صاف گردید. محلول حاصل توسط مقدار مناسب آمونیاک ۱۰% قلیایی و با اتیل اتر استخراج گردید. محلول اتری تا حد خشک تبخیر و به آن ۵ میلیلیتر اسیدکلریدریک ۱% افزوده شد. سپس محلول اسیدی حاصل به ۳ قسمت تقسیم گردید. ۱ قسمت به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و به ۲ قسمت دیگر معرف بوشاردا و مایر اضافه گردید. تشکیل رسوب سفید مایل به زرد با افزایش معرف مایر و تشکیل رسوب قهوهای رنگ با افزودن معرف بوشاردا نشان دهنده آلکالوئید است [۹۴، ۹۵].
۲-۱۱-۱-۱- معرف مایر
۲۰ گرم سود را داخل ۲۰۰ سیسی آب مقطر حل کرده و ۱ گرم فنیل فتالئین به آن اضافه میکنیم تا یک محلول ارغوانی به دست آید. سپس ۲۰ گرم پودر روی را به آن میافزائیم و هم میزنیم تا کاملا حل شود. بعد محتویات را حرارت میدهیم. برای اینکه آب آن تبخیر نشود، یک بشر را وارونه روی ظرف حاوی محلول میگذاریم تا بخار به داخل ظرف برگردد. محلول را تا زمانی حرارت میدهیم که رنگ ارغوانی از بین برود و مایع شفاف شود. این محلول را پس از سرد شدن میتوان در شیشۀ قهوهای رنگ داخل یخچال نگهداری میکنیم و همچنین به عنوان نگهدارنده میتوان مقداری پودر روی، داخل شیشه بریزیم.
۲-۱۱-۱-۲ معرف بوشاردا
برای درستکردن این معرف، دو گرم یدید پتاسیم را با دو گرم ید مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلیلیتر رسانده شد.
۲-۱۱-۲ آنتوسیانین
۲۵۰ میلیلیتر از غلظتهای مختلف عصاره گیاهان تهیه و به هر کدام ۱۰ میلی لیتر آب مقطر اضافه و محلول حاصل را به وسیله اسیدکلریدریک ۱ % اسیدی شد. حضور رنگ قرمز در PH 3-4 و تغییر رنگ با تغییرات PH نشان دهنده وجود آنتوسیانین میباشد [۹۶].
۲-۱۱-۳ تانن
۲۵۰ میلیلیتر ازغلظتهای مختلف عصاره گیاهان تهیه و به هر کدام ۱۰ میلیلیتر آب مقطر و ۴-۳ میلیلیتر سدیم کلراید ۱۰ % افزوده شد. دو قطره کلروفریک ۵% در یک لوله آزمایش به ۵ میلیلیتر آب مقطر افزوده شد. سپس چند قطره از محلول عصارهها به لوله آزمایش اضافه گردید. ایجاد رنگ سبز متمایل به آبی نشان دهنده وجود تانن است [۹۶].
۲-۱۱-۴ ساپونین
۵۰۰ میلیلیتر از غلظتهای مختلف عصاره گیاهان را تهیه و به هر کدام ۱۰ میلیلیتر آب مقطر اضافه و به مدت ۳۰ ثانیه به شدت تکان داده شد. ثابت ماندن کف به مدت نیم ساعت نشاندهنده حضور ساپونین است [۹۶].
۲-۱۱-۵ اندازه گیری میزان فنل عصارههای گیاهی
اندازه گیری میزان ترکیبات فنولی با بهره گرفتن از معرف فولین- سیوکالتیو ۱ اندازه گیری شد. به نیم میلیلیتر از غلظتهای ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶/۱۵ میلیگرم برمیلیلیتر واکنشگر فولین سیوکالتیو ۲/۰ نرمال اضافه شده، پس از ۵ دقیقه، دو میلیلیتر از محلول ۷۵ گرم بر لیتر کربنات سدیم به آن اضافه شد. جذب مخلوط ۲ ساعت بعد در طول موج ۷۶۰ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در مقابل بلانک قرائت شد [۹۷]. اسیدگالیک به عنوان استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون به کار رفت. میزان تام فنولیک بر اساس میزان معادل «میلیگرم اسیدگالیک در گرم عصاره» گزارش گردید. آزمایشات ۳ بار تکرار و میانگین آنها گزارش شد.
۲-۱۱-۵-۱ رسم منحنی استاندارد اسیدگالیک
دراین آزمایش اسید گالیک با غلظتهای ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶/۱۵ و ۸/۷ میلیگرم برمیلیلیتر تهیه، و به عنوان استاندارد استفاده شد. کلیه مراحل بر روی آنها همانند نمونههای مجهول انجام شد و درصد جذب هر نمونه در طول موج ۷۶۰ نانومتر با بهره گرفتن از اسپکتروفتومتر خوانده شد. منحنی جذب بر حسب غلظت رسم گردید.
Y= 0.0746X + 0.0819
Y- جذب خوانده شده از نمونه
X- غلظت عصاره
۲-۱۱-۶ بررسی فعالیت آنتیاکسیدانی
به منظور ارزیابی فعالیت آنتیاکسیدانی عصارهها از دو روش به داماندازی رادیکال دیفنیل پیکریل هیدرازیل (DPPH)[60] و قدرت احیاکنندگی، استفاده شد.
۲-۱۱-۶-۱ توانایی به داماندازی DPPH
رادیکال پایدار دی فنیل پیکریل هیدرازیل برای تعیین فعالیت به داماندازی رادیکال آزاد به کار رفت. به یک میلیلیتر از غلظتهای ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶/۱۵ و ۸/۷ میلیگرم بر میلیلیتر عصاره، یک میلیلیتر محلول ۱/۰ مولار DPPH اضافه شد و مخلوط حاصل را به خوبی تکان داده و به مدت ۱۵ دقیقه در اتاق تاریک قرار داده شد، سپس جذب مخلوط توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در ۵۱۷ نانومتر با بلانک متانول قرائت شد و اسیدآسکوربیک به عنوان استاندارد استفاده شد [۹۸]. در نهایت درصد به دام اندازی رادیکال دی فنیل پیکریل هیدرازیل (DPPH) طبق فرمول زیر محاسبه شد:
AS-AB / AS I% =
AB– جذب بلانک و -AS جذب نمونه یا استاندارد
سپس برای مقایسه فعالیت عصارهها از پارامتر IC50 استفاده شد. IC50 غلظتی از عصاره است که ۵۰% از رادیکالهای آزاد را مهار می کند.
۲-۱۱-۶-۲ تعیین قدرت احیاکنندگی
میزان قدرت احیاکنندگی عصارهها از طریق روش یِن و چِن ارزیابی شد. غلظتهای مختلف عصارههای گیاهی ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶/۱۵ و ۸/۷ میلیگرم بر میلی لیتر تهیه شد و با ۵/۲ میلیلیتر بافر فسفات ۲/۰ مولار با ۶/۶ =PH و ۵/۲ میلیلیتر محلول ۱% پتاسیم فریسیانید مخلوط شد و در دمای ۵۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲۰ دقیقه نگهداری شد. سپس ۵/۲ میلیلیتر از محلول تری کلرو استیکاسید به نمونهها اضافه شد تا واکنش متوقف شود. نمونهها به مدت ۱۰ دقیقه در دستگاه سانتریفیوژ قرار داده شدند و پس از اتمام این مرحله ۵/۲ میلیلیتر از قسمت بالای محلول با ۵/۲ میلیلیتر آب مقطر مخلوط شد و ۵/۰ میلیلیتر محلول ۱/۰ % فریککلراید به آن اضافه شد و بلافاصله جذب محلول در طول موج ۷۰۰ نانومتر ثبت شد [۹۹]. دراین آزمایش آسکوربیکاسید با غلظتهای ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶/۱۵ و ۸/۷ میلیگرم برمیلیلیتر به عنوان استاندارد استفاده شد. کلیه مراحل بر روی آنها همانند نمونههای مجهول تکرار گردید. در این آزمایش بلانک شامل همه اجزاء به جز عصاره است و دستگاه با بلانک صفر می شود.
۲-۱۲ تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه و تحلیل آماری به صورت فاکتوریل در یک طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. آنالیز داده های آماری به کمک نرمافزار[۶۱]SPSS نسخه ۱۶ انجام شد. برای تعیین اختلاف میانگین داده ها از آزمون دانکن در سطح اطمینان ۹۵% استفاده شد. داده ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده است.
فصل سوم
نتایج
۳-۱ ارزیابی فعالیت ضد میکروبی عصارهها
در این پژوهش در شرایط آزمایشگاهی فعالیت ضد میکروبی عصارههای متانولی بادام کوهی (Amygdalus scoparia)، بومادران (Achillea millefolium)، کلپوره (Teucrium polium)، گلپر (Heracleum persicum)، مریم گلی (Salvia officinallis) و عصاره متانولی ترکیبی (Amygdalus scoparia+Achillea millefolium) علیه ۴ سوش باکتریایی، استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سرئوس به عنوان باکتری های گرم مثبت و اشرشیا کلی و سالمونلا انتریتیدیس به عنوان باکتری های گرم منفی مورد آزمون قرار گرفت. عصارههای متانولی مورد مطالعه با آنتیبیوتیکهای استاندارد انتخابی مقایسه و نتایج آماری حاصل از غربالگری فعالیت ضد میکروبی آنها، به صورت جدول و نمودار نشان داده شده است.
در پایان لازم است خاطر نشان شود که اثر ضد میکروبی عصاره متانولی ترکیبی حاوی عصاره گیاه بادام کوهی و عصاره گیاه بومادران به علت توانایی قدرت بالاتر در مهار رشد باکتری های مورد بررسی، از دو تیره مختلف، مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۱-۱ نتایج ضد میکروبی حاصل از دیسک دیفیوژن
فعالیت ضد میکروبی عصارههای متانولی مورد مطالعه بر روی تعدادی از باکتری های گرم مثبت و منفی به روش دیسک دیفیوژن یا انتشار در آگار در محدوده غلظتهای ۱۰۰۰، ۷۵۰، ۵۰۰، ۲۵۰ و ۱۲۵ میلیگرم بر میلیلیتر مورد بررسی قرار گرفت و نتایج آنالیزهای غربالگری به شرح ذیل میباشد.
۳-۱-۱-۱ ارزیابی فعالیت ضد میکروبی عصاره بادام کوهی
قدرت ضد میکروبی غلظتهای مختلف عصاره متانولی بادام کوهی علیه سویههای مختلف مورد مطالعه بر اساس قطر هاله عدم رشد بررسی شد. همانطور که در نمودار (شکل ۳-۱) مشخص است در غلظتهای بالای عصاره متانولی بادام کوهی، میانگین قطر هاله عدم رشد در باکتریهای مورد مطالعه افزایش معنیداری داشته است. تاثیر عصاره این گیاه بر باکتری های گرم مثبت و منفی با تاثیر ضد میکروبی قوی قابل مشاهده است. نتایج نمودار نشان از حساسیت باکتری باسیلوس سرئوس با قطر هاله عدم رشد ۶۰/۰± ۷۶/۲۶ در برابر عصاره بادام کوهی دارد.
شکل ۳-۱: مقایسه میانگین قدرت ضد میکروبی غلظتهای مختلف عصاره متانولی بادام کوهی (Amygdalus scoparia) در برابر سویههای مختلف. حروف غیر همسان نشاندهنده وجود تغییرات معنیدار در سطح (P<0.05) بر اساس آزمون دانکن با ۳ بار تکرار میباشد. داده ها به صورت میانگین± خطای استاندارد ارائه شده است.
۳-۱-۱-۲- ارزیابی فعالیت ضد میکروبی عصاره بومادران
جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت abisho.ir مراجعه نمایید.
