میزان فعالیت SOD (U/ml whole blood)
= میزان SOD (U/gr Hb)
میزان هموگلوبین (ml /gr)
۰۱/۰ × میزان هموگلوبین (gr/dl) = میزان هموگلوبین (ml/gr)
۳-۱۵-اندازه ­گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز
فعالیت آنزیم GPX بر اساس روش پاگلیا و والنتین[۱۱۰] (۱۹۶۷) و توسط کیت رانسل ساخت شرکت راندوکس[۱۱۱] اندازه ­گیری شد.
اساس روش کار:
آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز (GPX)، واکنش اکسیداسیون گلوتاتیون احیا شده (GSH) را به وسیله کیومن هیدروپراکسید[۱۱۲] کاتالیز می­ کند.
در حضور آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز (GR) و NADPH، گلوتاتیون اکسیده شده (GSSG) به فرم احیا شده (GSH) تبدیل می­گردد.
کاهش جذب در طول موج ۳۴۰ نانومتر اندازه ­گیری می­ شود:

آماده ­سازی نمونه :
برای اندازه ­گیری فعالیت ویژه آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز، از خون کامل هپارینه استفاده
می­ شود. برای خون گوسفند، ۰۵/۰ میلی­لیتر از خون کامل هپارینه را با ۳ میلی­لیتر عامل رقیق کننده آماده شده موجود در کیت مخلوط می­نمائیم.
آماده ­سازی معرف­ها
کیت شرکت راندوکس برای اندازه ­گیری گلوتاتیون پراکسیداز حاوی ۴ نوع معرف به شرح زیر می باشد.
معرف شماره یک:
محتوی ۴ میلی­مول بر لیتر از ماده گلوتاتیون، ۵/۰ واحد بر لیتر (و یا کمی بیشتر) از آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز و ۳۴/۰ میلی­مول بر لیتر از آنزیم NADPH.
معرف شماره دو (بافر):
محتوی ۰۵/۰ میلی مول بر لیتر از بافر فسفات با اسیدیته ۲/۷ و ۳/۴ میلی­مول بر لیتر از ماده EDTA.
معرف شماره سه:
محتوی ۱۸/۰ میلی­مول بر لیتر از ماده کیومن هیدروپراکسید
معرف شماره چهار:
محتوی عامل رقیق کننده[۱۱۳]
آماده ­سازی معرف شماره یک :
یک ویال از معرف شماره یک را با ۱۰ میلی­لیتر از معرف شماره دو (بافر) مخلوط می­کنیم.
آماده ­سازی معرف شماره سه :
۱۰ میکرولیتر از معرف شماره سه را با ۱۰ میلی­لیتر آب مقطر مخلوط کرده و خوب تکان می­دهیم تا کاملاً حل شود.
آماده ­سازی معرف شماره چهار :
یک ویال از معرف شماره چهار را با ۲۰۰ میلی­لیتر آب مقطر مخلوط می­نمائیم .
اسپکتروفتومتری :
اندازه ­گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۳۴۰ نانومتر و باکووت کوارتز یک سانتی­متری، در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد و در مجاورت هوا انجام می گیرد. برای این منظور ۰۵/۰ میلی­لیتر از نمونه خون رقیق شده را با ۵/۲ میلی­لیتر از معرف شماره یک آماده شده و ۱/۰ میلی­لیتر کیومن هیدروپراکسید آماده شده مخلوط می­کنیم. برای تهیه بلانک (شاهد) آزمایش، ۰۵/۰ میلی­لیتر آّب مقطر را با ۵/۲ میلی­لیتر از معرف شماره یک آماده شده و ۱/۰ میلی­لیتر کیومن هیدروپراکسید آماده شده، مخلوط می­نمائیم. سپس توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب نمونه را در ۳ زمان، یکی در ثانیه اول (A1) یکی در دقیقه اول (A2) و دیگری در دقیقه دوم (A3) در مقابل هوا قرائت می­کنیم.
آن گاه از طریق فرمول­های زیر میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسید را محاسبه می­نمائیم:
(تفاوت جذب در دقیقه)
۸۴۱۲ = میزان گلوتاتیون پراکسیداز در خون لیز شده (U/L)
در مرحله بعد باید میزان گلوتاتیون پراکسیداز بدست آمده برای هر نمونه (بر حسب واحد بر لیتر) را از میزان گلوتاتیون بدست آمده برای نمونه شاهد (بر حسب واحد بر لیتر)، کم کنیم. از طرفی چون نتیجه بدست آمده مربوط به میزان فعالیت این آنزیم در نمونه خون رقیق شده است، بنابراین آنرا در فاکتور رقت که در اینجا ۶۰ می باشد، ضرب می­نمائیم تا میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در خون کامل (بر حسب واحد بر لیتر) بدست آید. همچنین برای جلوگیری از ایجاد خطا در آزمایش، در نتیجه تغییرات هموگلوبین خون، میزان فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز بر حسب واحد گرم هموگلوبین (U/gr Hb) اندازه ­گیری می­ شود. برای این منظور ابتدا، میزان هموگلوبین هر نمونه را اندازه ­گیری می­کنیم. مقدار اندازه ­گیری شده بر حسب گرم بر دسی­لیتر (gr/dl) می­باشد. با ضرب این عدد در عدد ۱۰، میزان هموگلوبین بر حسب گرم بر لیتر (gr/l) محاسبه می­گردد. آن گاه با تقسیم میزان فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز بر حسب واحد بر لیتر، بر میزان هموگلوبین بر حسب گرم بر لیتر، میزان فعالیت ویژه گلوتاتیون پراکسیداز بر حسب واحد گرم بر هموگلوبین (U/gr Hb) بدست می‌آید.
۳-۱۶-اندازه‌گیری کاتالاز گلبول‌های قرمز خون
میزان فعالیت کاتالاز در همولیز تهیه شده از گلبول‌های قرمز بوسیله روش Beers و Sizer در سال ۱۹۵۲ اندازه‌گیری شد.
فعالیت کاتالاز با بهره گرفتن از اکسیداسیون آهن زایلنول ارنج(Xylenol orange) اندازه‌گیری شد.
نمونه‌های همولیز گلبول­های قرمز که حاوی کاتالاز هستند در فواصل زمانی مختلف با انکوبه می‌شوند. قبل از آنکه این ترکیب انکوبه شده با محلول زایلنول ارنج سریعاً مخلوط شود. از این طریق باقیمانده اندازه‌گیری می‌شود. پس از ۳۰ دقیقه انکوباسیون نمونه در درجه حرارت اتاق، جذب نوری آن در ۵۶۰ نانومتر خوانده می‌شود. میزان تجزیه با میزان فعالیت کاتالاز در نمونه متناسب است.
۳-۱۷-اندازه‌گیری مالون دی آلدئید (MDA) گلبول‌های قرمز خون
مالون دی آلدئید (MDA) بر اساس روش اسیدتیوباربیتوریک اندازه ­گیری شد.
مالات دهیدروژناز (MDA) بر اساس روش اسید تیوباربیتوریک (Thioborbituric acid) که توسطPlaser و همکاران در سال ۱۹۶۶ طراحی شد، ‌اندازه‌گیری شد.
اسیدتیوباربیتوریک و MDA با یکدیگر واکنش می‌دهند تا یک ترکیب شیف- باز (Schiffbase) در شرایط اسیدی و درجه حرارت بالا تشکیل دهند. در این حالت یک محصول رنگی بوجود می‌آید که می‌توان آن را به آسانی به روش اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری کرد.
۳-۱۸-روش تجزیه و تحلیل دادها
پس از جمع آوری داده ­ها توسط نرم افزار آماریspss ویرایش ۱۶ و آزمون­های آماری t _ test، ANOVA و دانکن در سطح ۰۵/۰>pمورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
فصل چهارم: نتایج
۴-۱- بررسی وزن موش صحرایی نر بالغ از نژاد Wister در گروه­های مورد بررسی در طول دوره­ آزمایش
در مقایسه­ میانگین وزن بین گروه کنترل و دیگر گروه­ها اختلاف آماری معناداری مشاهده نگردید. در طول دوره­ مطالعه در گروه­های مختلف میانگین وزن همه­ی گروه­ها به جز گروه ۶ یک افزایش تدریجی تا انتهای دوره را نشان داد که اختلاف آماری معناداری در مقایسه با ابتدای دوره ایجاد گردید(۰۵/۰>P). (جدول ۴-۱)
جدول ۴-۱: مقایسه­ میانگین (± انحراف معیار) وزن (گرم) موش صحرایی نر بالغ از نژاد Wister در گروه­های مورد بررسی در طول دوره­ آزمایش

جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت abisho.ir مراجعه نمایید.

حق انحصاری © 2021 مطالب علمی گلچین شده. کلیه حقوق محف