روش کار:

در ابتدا ژل متراکم کننده(Stacking or spacer gel) 10 درصد و ژل جداکننده (Resolving or separating gel) 15 درصد تهیه شدند.

پس از بسته شدن کامل ژل شیشه بر تانک الکتروفورز سوار گردید.

سپس بافر الکتروفورز را در محفظه های بالا و پایین ریخته و حباب های هوا با کمک سرنگ بزرگ خارج شد.

نمونه ها با بافر بارگذاری مخلوط شده و به مدت ۵ دقیقه در آب جوش قرار داده شدند.

مقدار مناسب از نمونه ها و مارکر پروتئین درون چاهک ها ریخته شد.

ولتاژ دستگاه در ابتدا روی ۸۰ و سپس روی ۱۰۰ ولت تنظیم گردید.

پس از اتمام الکتروفورز فژل از روی صفحه شیشه ای برداشته شده و برای وسترن بلات اقدام گردید.
جهت دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت jemo.ir مراجعه نمایید.

۳-۱۱-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم

برای بیان پروتئین نوترکیب HPV ، پس از تهیه باکتری های مستعد از میزبان بیانی، ترانسفورم این باکتری ها با پلاسمید PET28a(+)-HPV انجام شد و بیان پروتئین نوترکیب در آن به کمک IPTG یک میلی مولار القا گردید.
مواد و وسایل مورد نیاز:
۱- باکتری بیانی E.coli BL21 DE3 .
۲- محلول ها و ملزومات برای تهیه سلول های مستعد
۳- محلول ها و ملزومات برای ترانسفورماسیون
۴- پلاسمید نوترکیب (در اینجا PET28a(+)-HPV )
*این پلاسمید طبق روش ذکر شده در قسمت های قبلی استخراج گردید.
۵- آنتی بیوتیک مناسب
*کانامایسین(۱۰۰µg/ml)
به این منظور با حل کردن ۱g پودر کانامایسین در۱۰ml آب مقطر استریل تزریقی ،یک استوک با غلظت ۱۰۰mg/ml تهیه کرده و به ازای هر ۱ml از محیط کشت مقدار ۱µl از استوک آنتی بیوتیک اضافه شد.
۶- محیط کشت LB مایع
۷- محیط کشت LB آگار
۸- محیط کشت ۲xYT مایع
۹- استوک IPTG(1M)(FermentaseTQiagen)
۱۰- اسپکتروفتومتر
۱۱-انکوباتور
۱۲- سمپلر،سرسمپلر و فالکون استریل و اپندورف استریل

۳-۱۲-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی

پس از این مراحل که برای تایید و ارزیابی پروتئین تولید شده از یک کلونی انتخاب شده کشت انبوه در LB broth به مقدار ۱ لیتر تهیه شد،القا با IPTG صورت گرفت و بعد از ۴ ساعت از کل کشت جسم سلولی تهیه شد.در مرحله بعد از جسم سلولی باکتری‌ها به روش Denaturing وRefolding پروتئین ها تخلیص شدند.

۳-۱۳-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا

کشت باکتری در یک لیتر محیط کشت انجام شد و پس از رسیدن به OD مناسب ۸/۰ و القاء با IPTG یک میلی مولار رسوب باکتریایی آن جمع آوری شد.
مواد و وسایل مورد نیاز:
۱– استوک باکتری بیانی حاوی وکتور نوترکیب
۲- محیط کشت مایع ۲xYT به همراه گلوکز یک درصدحاوی ۱۰۰ میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین(برای ۱ لیتر)
۳-IPTG (1mM)(Qiagen)
۴- انکوباتور
۵- سانتریفوژ
۶- سرسمپلرفاپندورف و فالکون استریل
روش کار:
۱-مقدار lµ۱۰۰ از استوک سلول های بیانی دارای وکتور نوترکیب موجود در ۷۰- درجه سانتی گراد در۱۰ml محیط کشت مایع ۲xYT حاوی گلوکز یک درصدحاوی کانامایسین کشت داده شد و یک شب در انکوباتور ۳۰ درجه سانتی گراد قرار گرفت.
۲-صبحlµ۲×۳۰۰ از باکتری های کشت شب گذشته در ۲×۵ml محیط کشت مایع ۲xYT حاوی گلوکز ۱ درصد حاوی کانامایسین کشت داده شد و برای رشد باکتری و اشباع کامل محیط، حدود ۳-۲ ساعت در ۳۰ درجه سانتی گراد انکوبه گردید.
۳-هر یک از محیط های کشت ۵ml اشباع شده به حجم ۵۰۰ml رسید و مجددا برای رشد باکتری در ۳۰ درجه سانتی گراد انکوبه گردید.
۴-وقتی OD600 (جذب نوری در طول موج ۶۰۰nm) در محیط کشت به ۸/۰ رسید، محتویات فوق به مدت ۲۰ دقیقه در یخچال قرار گرفت.
۵-پس از ۲۰ دقیقه، ۱ml از باکتری های فوق به عنوان نمونه قبل از القاء برداشت شد و مابقی باکتری با غلظت ۱mM ازIPTG برای بیان پروتئین نوترکیب القاء شد و مجددا در انکوباتور ۳۰ درجه سانتی گراد قرار گرفت.
۶- حدود ۶ ساعت بعد از القاء، نمونه های بعد از القاء نیز جمع آوری شدند. به نحوی که در هر فالکون ۲۵۰ml کشت باکتری رسوب گیری شد. به این منظور رسوب گیری طی ۵ بار سانتریفوژ برای هر فالکون انجام شد.
*برای برداشت نمونه های مذکور ،رسوب باکتریایی هر یک از کشت ها به مدت ۵ دقیقه در ۶۰۰۰rpm سانتریفوژ گردید.
*این رسوب می تواند پس از خشک شدن در ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شود و یا مستقیما وارد مراحل تخلیص شود.

۳-۱۴-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS

SDS–PAGE روشی مناسب و سریع در مطالعه پروتئین ها می باشد و معمولا برای بررسی مراحل خالص سازی ، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن ملکولی پروتئین ها به کار می رود.
در این روش با بهره گرفتن از ژل پلی آکریل آمید (Polyacrylamide ) که پلی‌مری بی بار و غیر فعال از نظر شیمیایی است و سدیم دودسیل سولفات که دترجنتی آنیونی می باشد، پروتئین‌ها براساس وزن ملکولی خود تفکیک می گردند. با توجه به اندازه منافذ ژل پروتئین های کوچکتر با مزاحمت کمتر و پروتئین های بزرگتر با مشکل بیشتری حرکت می کنند و مسافت طی شده در پایان الکتروفورز با وزن ملکولی آنها تناسب دارد.این مسئله اساس تعیین وزن ملکولی در روش SDS-PAGE را تشکیل می‌دهد. SDS به مناطق آبگریز پروتئین ها متصل می شود و بار طبیعی آنها را می‌پوشاند در نتیجه بار منفی با تراکم مشابه در آنها ایجاد می‌کند. ماده احیا کننده‌ای هم که در بافر نمونه به کار می رود پیوندهای دی سولفیدی را شکسته و پروتئین کاملا باز می شود. بنابراین پروتئین ها بار منفی با تراکم مشابه یافته و در دامنه وسیعی از PH به طرف آند حرکت می کنند.
مواد و وسایل مورد نیاز:

محلول استوک آکریل آمید(۳۰٫۸ درصد)

بالفر ژل پایین

بافر ژل بالا

بافر الکترود

پرسولفات آمونیوم(سیگما) ۱۰ درصد در آب مقطر

بافر نمونه

تمد(سیگما) ۱۰ درصد در آب مقطر

استاندارد وزن ملکولی (Fermentas)

منبع نیرو

تانک الکتروفورز عمودی

صفحات شیشه ای و فاصله اندازه ها

گیره

سرنگ هامیلتون

آب مقطر

روش تهیه محلول ها و بافرها

محلول استوک آکریل آمید(۳۰٫۸ درصد)

۳۰ گرم آکریل آمید و ۰٫۸ گرم بیس آکریل آمید در آب مقطر تا حجم ۱۰۰ میلی لیتر حل و با کاغذ واتمن صاف گردید(نگهداری در ظرف تیره و یخچال)

بافر ژل پایین: